雙向電泳設(shè)備技術(shù)的應(yīng)用及其發(fā)展前景

添加時(shí)間：2016/10/5 13:57:00

一、前言
雙向電泳設(shè)備（Two-dimensional（2D） gel electrophoresis）是蛋白分離的黃金標(biāo)準(zhǔn)，由此可 以分析生物樣品的顯著差別，產(chǎn)生的結(jié)果用于診斷疾病、發(fā)現(xiàn)新的藥物靶標(biāo)和分析潛在的環(huán)境和藥物的毒性。雙向電泳分離技術(shù)利用復(fù)雜蛋白 混合物中單個(gè)組分的電泳遷移，第一向通過電荷的不同分離，另一向通過質(zhì)量的不同分離。雙向電泳協(xié)同質(zhì)譜技術(shù)是正在出現(xiàn)的蛋白組學(xué)領(lǐng)域 的中心技術(shù)。
迄今為止，雙向電泳技術(shù)一直是使用昂貴的專門儀器，要求大實(shí)驗(yàn)室的積累和專門的訓(xùn)練。為了保證結(jié)果的重復(fù)性，需要延長(zhǎng)時(shí)間和技術(shù)專家 的建議。
二、摘要
電泳是在溶劑中通過電場(chǎng)轉(zhuǎn)移帶電分子，任何帶電的離子或者基團(tuán)放置在電場(chǎng)中都將會(huì)遷移。除非在它們的等電點(diǎn)，大多數(shù)生物聚合物在任何 pH值時(shí)都帶有凈電荷，它們將會(huì)以與電荷密度成比例的方式移動(dòng)，向其對(duì)應(yīng)的電極方向按各自的速度進(jìn)行泳動(dòng)，使組分分離成狹窄的區(qū)帶。分 子在電場(chǎng)中的遷移取決于電場(chǎng)的強(qiáng)度、凈電荷、分子的大小和形狀、離子強(qiáng)度、粘度和分子移動(dòng)介質(zhì)的溫度。作為一種分析工具，電泳簡(jiǎn)單、 快速，并且具有高靈敏度。用來研究單一、帶電荷的分子的特性，也用來作為一種分離技術(shù)。
雙向電泳（Two-dimensional（2D） gel electrophoresis）是一項(xiàng)基于蛋白的兩種不同特性：電荷和質(zhì)量來分離蛋白的技術(shù)。首先基于蛋白固 有電荷，通過等電聚焦（isoelectric focusing IEF）進(jìn)行第一向蛋白分離，然后根據(jù)蛋白的質(zhì)量，在第二向中通過SDS-PAGE電泳進(jìn)行蛋白分 離。使用這兩種不同的分離技術(shù)的結(jié)果是增高了對(duì)蛋白的分辨率。
三、雙向電泳實(shí)驗(yàn)原理
IEF/SDS-PAGE雙向電泳法1975年O′Farrall等人根據(jù)不同組份之間的等電點(diǎn)差異和分子量差異建立了IEF/Sd S-PAGE雙向電泳。其中IEF電泳（ 管柱狀）為第一向，SDS-PAGE為第二向（平板）。在進(jìn)行第一向IEF電泳時(shí)，電泳體系中應(yīng)加入高濃度尿素、適量非離子型去污劑NP-40。蛋白 質(zhì)樣品中除含有這兩種物質(zhì)外還應(yīng)有二硫蘇糖醇以促使蛋白質(zhì)變性和肽鏈?zhǔn)嬲埂?br> 2-DE的第一向電泳等電聚焦是基于等電點(diǎn)不同而將蛋白粗步分離，第二向SDS-PAGE是基于蛋白質(zhì)分子量不同，而將一向分離后的蛋白進(jìn)一步分 離。這樣就可以得到蛋白質(zhì)等電點(diǎn)和分子量的信息。
IEF電泳結(jié)束后，將圓柱形凝膠在SDS-PAGE所應(yīng)用的樣品處理液（內(nèi)含SDS、β-巰基乙醇）中振蕩平衡，然后包埋在SDS-PAGE的凝膠板上端，即 可進(jìn)行第二向電泳。
IEF/ SDS-PAGE雙向電泳對(duì)蛋白質(zhì)（包括核糖體蛋白、組蛋白等）的分離是極為精細(xì)的，因此特別適合于分離細(xì)菌或細(xì)胞中復(fù)雜的蛋白質(zhì)組分。 四、實(shí)驗(yàn)操作步驟（雙向電泳中一律使用超純水）
（一） 樣品的溶解
取純化后的晶體蛋白3.0mg，加入300ul裂解液(1mg蛋白:100ul裂解液)振蕩器上振蕩10min左右，共處理一個(gè)小時(shí)。其中每隔10～15分鐘振蕩一 次，然后13200rpm離心15min除雜質(zhì)，取上清分裝，每管70ul，—80oC保存。
（二） Bradford法測(cè)蛋白含量
取0.001g BSA（牛血清白蛋白）用1ml超純水溶解,測(cè)定BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品蛋白含量。
取7個(gè)10ml的離心管，首先在5個(gè)離心管中按次序加入0ul, 5ul, 10ul, 15ul, 20ul 的BSA溶解液，另2管中分別加入2 ul的待測(cè)樣品溶液，再在 每管中加入相應(yīng)體積的雙蒸水（總體積為80ul），然后，各管中分別加入4ml的Bradford液（原來配好的Bradford液使用前需再取需要的劑量過 濾一遍方能使用），搖勻，2min在595nm下，按由低到高的濃度順序測(cè)定各濃度BSA的OD值，再測(cè)樣品OD值。(測(cè)量過程要在一個(gè)小時(shí)內(nèi)完成)。 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式：Y= aX+b.其中Y為 OD值，X為蛋白含量。 a、b通過作圖輸入數(shù)據(jù)可知，相關(guān)系數(shù)通過輸入數(shù)據(jù)，作圖，軟件分析可得OD值。 比色皿用70%的乙醇保存，待用時(shí)用雙蒸水沖洗，再用無水乙醇沖洗，雙蒸水沖洗，再加入待測(cè)樣品溶液潤(rùn)洗，然后，加入樣品，測(cè)定OD值。 （三）水化液的制備
稱取2.0mg 的DTT，用700ul水化液儲(chǔ)液溶解后,加入8ul 0.05% 的溴酚蘭，3.5ul（0.5%v/v）IPG buffer (pH 3-10)振蕩混勻，13200rpm離心 15min 除雜質(zhì)，取上清。
在含300ug 蛋白（經(jīng)驗(yàn)值）的樣品溶解液中加入水化液，至終體積為340ul，振蕩器上振蕩混合,13200rpm離心15min除雜質(zhì)，取上清。
（四）第一向等電聚焦
1. 從冰箱中取-20℃冷凍保存的水化上樣緩沖液（I）（不含DTT，不含Bio-Lyte）一小管（1ml/管），置室溫溶解。
2. 在小管中加入0.01g DTT， Bio-Lyte 4-6、5-7各2.5ml，充分混勻。
3. 從小管中取出400ml水化上樣緩沖液，加入100ml樣品，充分混勻。
4. 從冰箱中取-20℃冷凍保存的IPG預(yù)制膠條（17cm pH 4-7），室溫中放置10分鐘。
5. 沿著聚焦盤或水化盤中槽的邊緣至左而右線性加入樣品。在槽兩端各1cm左右不要加樣，中間的樣品液一定要連貫。注意：不要產(chǎn)生氣泡。 否則影響到膠條中蛋白質(zhì)的分布。
6. 當(dāng)所有的蛋白質(zhì)樣品都已經(jīng)加入到聚焦盤或水化盤中后，用鑷子輕輕的去除預(yù)制IPG膠條上的保護(hù)層。
7. 分清膠條的正負(fù)極，輕輕地將IPG膠條膠面朝下置于聚焦盤或水化盤中樣品溶液上，使得膠條的正極（標(biāo)有+）對(duì)應(yīng)于聚焦盤的正極。確保膠 條與電極緊密接觸。不要使樣品溶液弄到膠條背面的塑料支撐膜上，因?yàn)檫@些溶液不會(huì)被膠條吸收。同樣還要注意不使膠條下面的溶液產(chǎn)生氣 泡。如果已經(jīng)產(chǎn)生氣泡，用鑷子輕輕地提起膠條的一端，上下移動(dòng)膠條，直到氣泡被趕到膠條以外。
8. 在每根膠條上覆蓋2-3ml礦物油，防止膠條水化過程中液體的蒸發(fā)。需緩慢的加入礦物油，沿著膠條，使礦物油一滴一滴慢慢加在塑料支撐 膜上。
9. 對(duì)好正、負(fù)極，蓋上蓋子。設(shè)置等電聚焦程序。
10.聚焦結(jié)束的膠條。立即進(jìn)行平衡、第二向SDS-PAGE電泳，否則將膠條置于樣品水化盤中，-20℃冰箱保存。
（五）第二向SDS-PAGE電泳
1. 配制10%的丙烯酰胺凝膠兩塊。配80ml凝膠溶液，每塊凝膠40ml，將溶液分別注入玻璃板夾層中，上部留1cm的空間，用MilliQ水、乙醇或水 飽和正丁醇封面，保持膠面平整。聚合30分鐘。一般凝膠與上方液體分層后，表明凝膠已基本聚合。
2. 待凝膠凝固后，倒去分離膠表面的MilliQ水、乙醇或水飽和正丁醇，用MilliQ水沖洗。
3. 從-20℃冰箱中取出的膠條，先于室溫放置10分鐘，使其溶解。
4. 配制膠條平衡緩沖液I。
5．在桌上先放置干的厚濾紙，聚焦好的膠條膠面朝上放在干的厚濾紙上。將另一份厚濾紙用MilliQ水浸濕，擠去多余水分，然后直接置于膠條 上，輕輕吸干膠條上的礦物油及多余樣品。同軸電纜這可以減少凝膠染色時(shí)出現(xiàn)的縱條紋 。
6. 將膠條轉(zhuǎn)移至溶漲盤中，每個(gè)槽一根膠條，在有膠條的槽中加入5ml膠條平衡緩沖液I。將樣品水化盤放在水平搖床上緩慢搖晃15分鐘。
7. 配制膠條平衡緩沖液II。
8. 第一次平衡結(jié)束后，徹底倒掉或吸掉樣品水化盤中的膠條平衡緩沖液I。并用濾紙吸取多余的平衡液（將膠條豎在濾紙上，以免損失蛋白或 損壞凝膠表面）。再加入膠條平衡緩沖液II，繼續(xù)在水平搖床上緩慢搖晃15分鐘。
9. 用濾紙吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠上方玻璃板間多余的液體。將處理好的第二向凝膠放在桌面上，長(zhǎng)玻璃板在下，短玻璃板朝上，凝膠的 頂部對(duì)著自己。
10.將瓊脂糖封膠液進(jìn)行加熱溶解。
11.將10×電泳緩沖液，用量筒稀釋10倍，成1×電泳緩沖液。趕去緩沖液表面的氣泡。
12.第二次平衡結(jié)束后，徹底倒掉或吸掉樣品水化盤中的膠條平衡緩沖液II。并用濾紙吸取多余的平衡液（將膠條豎在濾紙上，以免損失蛋白或 損壞凝膠表面）。
13.將IPG膠條從樣品水化盤中移出，用鑷子夾住膠條的一端使膠面完全浸末在1×電泳緩沖液中。然后將膠條膠面朝上放在凝膠的長(zhǎng)玻璃板上。 其余膠條同樣操作。
14.將放有膠條的SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)移到灌膠架上，短玻璃板一面對(duì)著自己。在凝膠的上方加入低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液。
15.用鑷子、壓舌板或是平頭的針頭，輕輕地將膠條向下推，使之與聚丙烯酰胺凝膠膠面完全接觸。注意不要在膠條下方產(chǎn)生任何氣泡。在用鑷 子、壓舌板或平頭針頭推膠條時(shí)，要注意是推動(dòng)凝膠背面的支撐膜，不要碰到膠面。
16.放置5分鐘，使低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液徹底凝固。
17.在低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液完全凝固后。將凝膠轉(zhuǎn)移至電泳槽中。
18.在電泳槽加入電泳緩沖液后，接通電源，起始時(shí)用的低電流（5mA/gel/17cm）或低電壓，待樣品在完全走出IPG膠條，濃縮成一條線后，再 加大電流（或電壓）（20-30mA/gel/17cm），待溴酚藍(lán)指示劑達(dá)到底部邊緣時(shí)即可停止電泳。
19.電泳結(jié)束后，輕輕撬開兩層玻璃，取出凝膠，并切角以作記號(hào)（戴手套，防止污染膠面）。
20.進(jìn)行染色。
注：整個(gè)雙向電泳實(shí)驗(yàn)中全部使用超純水，盡量減少離子的影響。
五、應(yīng)用前景
雙向電泳技術(shù)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的基礎(chǔ)技術(shù)平臺(tái).應(yīng)用雙向電泳技術(shù)分離腫瘤與正常組織細(xì)胞之間的差異表達(dá)蛋白可為尋找腫瘤的特異標(biāo)志物、 揭示腫瘤的發(fā)病機(jī)制以及開發(fā)新的腫瘤治療方式及治療藥物等提供新途徑.
電泳技術(shù)除了用于小分子物質(zhì)的分離分析外，主要用于蛋白質(zhì)、核酸、酶，甚至病毒與細(xì)胞的研究。由于某些電泳法設(shè)備簡(jiǎn)單，操作方便， 具有高分辨率及選擇性特點(diǎn)，已成為醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中常用的技術(shù)。