雙向電泳設備技術的應用及其發展前景

添加時間：2016/10/5 13:57:00

一、前言
雙向電泳設備（Two-dimensional（2D） gel electrophoresis）是蛋白分離的黃金標準，由此可 以分析生物樣品的顯著差別，產生的結果用于診斷疾病、發現新的藥物靶標和分析潛在的環境和藥物的毒性。雙向電泳分離技術利用復雜蛋白 混合物中單個組分的電泳遷移，第一向通過電荷的不同分離，另一向通過質量的不同分離。雙向電泳協同質譜技術是正在出現的蛋白組學領域 的中心技術。
迄今為止，雙向電泳技術一直是使用昂貴的專門儀器，要求大實驗室的積累和專門的訓練。為了保證結果的重復性，需要延長時間和技術專家 的建議。
二、摘要
電泳是在溶劑中通過電場轉移帶電分子，任何帶電的離子或者基團放置在電場中都將會遷移。除非在它們的等電點，大多數生物聚合物在任何 pH值時都帶有凈電荷，它們將會以與電荷密度成比例的方式移動，向其對應的電極方向按各自的速度進行泳動，使組分分離成狹窄的區帶。分 子在電場中的遷移取決于電場的強度、凈電荷、分子的大小和形狀、離子強度、粘度和分子移動介質的溫度。作為一種分析工具，電泳簡單、 快速，并且具有高靈敏度。用來研究單一、帶電荷的分子的特性，也用來作為一種分離技術。
雙向電泳（Two-dimensional（2D） gel electrophoresis）是一項基于蛋白的兩種不同特性：電荷和質量來分離蛋白的技術。首先基于蛋白固 有電荷，通過等電聚焦（isoelectric focusing IEF）進行第一向蛋白分離，然后根據蛋白的質量，在第二向中通過SDS-PAGE電泳進行蛋白分 離。使用這兩種不同的分離技術的結果是增高了對蛋白的分辨率。
三、雙向電泳實驗原理
IEF/SDS-PAGE雙向電泳法1975年O′Farrall等人根據不同組份之間的等電點差異和分子量差異建立了IEF/Sd S-PAGE雙向電泳。其中IEF電泳（ 管柱狀）為第一向，SDS-PAGE為第二向（平板）。在進行第一向IEF電泳時，電泳體系中應加入高濃度尿素、適量非離子型去污劑NP-40。蛋白 質樣品中除含有這兩種物質外還應有二硫蘇糖醇以促使蛋白質變性和肽鏈舒展。
2-DE的第一向電泳等電聚焦是基于等電點不同而將蛋白粗步分離，第二向SDS-PAGE是基于蛋白質分子量不同，而將一向分離后的蛋白進一步分 離。這樣就可以得到蛋白質等電點和分子量的信息。
IEF電泳結束后，將圓柱形凝膠在SDS-PAGE所應用的樣品處理液（內含SDS、β-巰基乙醇）中振蕩平衡，然后包埋在SDS-PAGE的凝膠板上端，即 可進行第二向電泳。
IEF/ SDS-PAGE雙向電泳對蛋白質（包括核糖體蛋白、組蛋白等）的分離是極為精細的，因此特別適合于分離細菌或細胞中復雜的蛋白質組分。 四、實驗操作步驟（雙向電泳中一律使用超純水）
（一） 樣品的溶解
取純化后的晶體蛋白3.0mg，加入300ul裂解液(1mg蛋白:100ul裂解液)振蕩器上振蕩10min左右，共處理一個小時。其中每隔10～15分鐘振蕩一 次，然后13200rpm離心15min除雜質，取上清分裝，每管70ul，—80oC保存。
（二） Bradford法測蛋白含量
取0.001g BSA（牛血清白蛋白）用1ml超純水溶解,測定BSA標準曲線及樣品蛋白含量。
取7個10ml的離心管，首先在5個離心管中按次序加入0ul, 5ul, 10ul, 15ul, 20ul 的BSA溶解液，另2管中分別加入2 ul的待測樣品溶液，再在 每管中加入相應體積的雙蒸水（總體積為80ul），然后，各管中分別加入4ml的Bradford液（原來配好的Bradford液使用前需再取需要的劑量過 濾一遍方能使用），搖勻，2min在595nm下，按由低到高的濃度順序測定各濃度BSA的OD值，再測樣品OD值。(測量過程要在一個小時內完成)。 標準曲線方程式：Y= aX+b.其中Y為 OD值，X為蛋白含量。 a、b通過作圖輸入數據可知，相關系數通過輸入數據，作圖，軟件分析可得OD值。 比色皿用70%的乙醇保存，待用時用雙蒸水沖洗，再用無水乙醇沖洗，雙蒸水沖洗，再加入待測樣品溶液潤洗，然后，加入樣品，測定OD值。 （三）水化液的制備
稱取2.0mg 的DTT，用700ul水化液儲液溶解后,加入8ul 0.05% 的溴酚蘭，3.5ul（0.5%v/v）IPG buffer (pH 3-10)振蕩混勻，13200rpm離心 15min 除雜質，取上清。
在含300ug 蛋白（經驗值）的樣品溶解液中加入水化液，至終體積為340ul，振蕩器上振蕩混合,13200rpm離心15min除雜質，取上清。
（四）第一向等電聚焦
1. 從冰箱中取-20℃冷凍保存的水化上樣緩沖液（I）（不含DTT，不含Bio-Lyte）一小管（1ml/管），置室溫溶解。
2. 在小管中加入0.01g DTT， Bio-Lyte 4-6、5-7各2.5ml，充分混勻。
3. 從小管中取出400ml水化上樣緩沖液，加入100ml樣品，充分混勻。
4. 從冰箱中取-20℃冷凍保存的IPG預制膠條（17cm pH 4-7），室溫中放置10分鐘。
5. 沿著聚焦盤或水化盤中槽的邊緣至左而右線性加入樣品。在槽兩端各1cm左右不要加樣，中間的樣品液一定要連貫。注意：不要產生氣泡。 否則影響到膠條中蛋白質的分布。
6. 當所有的蛋白質樣品都已經加入到聚焦盤或水化盤中后，用鑷子輕輕的去除預制IPG膠條上的保護層。
7. 分清膠條的正負極，輕輕地將IPG膠條膠面朝下置于聚焦盤或水化盤中樣品溶液上，使得膠條的正極（標有+）對應于聚焦盤的正極。確保膠 條與電極緊密接觸。不要使樣品溶液弄到膠條背面的塑料支撐膜上，因為這些溶液不會被膠條吸收。同樣還要注意不使膠條下面的溶液產生氣 泡。如果已經產生氣泡，用鑷子輕輕地提起膠條的一端，上下移動膠條，直到氣泡被趕到膠條以外。
8. 在每根膠條上覆蓋2-3ml礦物油，防止膠條水化過程中液體的蒸發。需緩慢的加入礦物油，沿著膠條，使礦物油一滴一滴慢慢加在塑料支撐 膜上。
9. 對好正、負極，蓋上蓋子。設置等電聚焦程序。
10.聚焦結束的膠條。立即進行平衡、第二向SDS-PAGE電泳，否則將膠條置于樣品水化盤中，-20℃冰箱保存。
（五）第二向SDS-PAGE電泳
1. 配制10%的丙烯酰胺凝膠兩塊。配80ml凝膠溶液，每塊凝膠40ml，將溶液分別注入玻璃板夾層中，上部留1cm的空間，用MilliQ水、乙醇或水 飽和正丁醇封面，保持膠面平整。聚合30分鐘。一般凝膠與上方液體分層后，表明凝膠已基本聚合。
2. 待凝膠凝固后，倒去分離膠表面的MilliQ水、乙醇或水飽和正丁醇，用MilliQ水沖洗。
3. 從-20℃冰箱中取出的膠條，先于室溫放置10分鐘，使其溶解。
4. 配制膠條平衡緩沖液I。
5．在桌上先放置干的厚濾紙，聚焦好的膠條膠面朝上放在干的厚濾紙上。將另一份厚濾紙用MilliQ水浸濕，擠去多余水分，然后直接置于膠條 上，輕輕吸干膠條上的礦物油及多余樣品。同軸電纜這可以減少凝膠染色時出現的縱條紋 。
6. 將膠條轉移至溶漲盤中，每個槽一根膠條，在有膠條的槽中加入5ml膠條平衡緩沖液I。將樣品水化盤放在水平搖床上緩慢搖晃15分鐘。
7. 配制膠條平衡緩沖液II。
8. 第一次平衡結束后，徹底倒掉或吸掉樣品水化盤中的膠條平衡緩沖液I。并用濾紙吸取多余的平衡液（將膠條豎在濾紙上，以免損失蛋白或 損壞凝膠表面）。再加入膠條平衡緩沖液II，繼續在水平搖床上緩慢搖晃15分鐘。
9. 用濾紙吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠上方玻璃板間多余的液體。將處理好的第二向凝膠放在桌面上，長玻璃板在下，短玻璃板朝上，凝膠的 頂部對著自己。
10.將瓊脂糖封膠液進行加熱溶解。
11.將10×電泳緩沖液，用量筒稀釋10倍，成1×電泳緩沖液。趕去緩沖液表面的氣泡。
12.第二次平衡結束后，徹底倒掉或吸掉樣品水化盤中的膠條平衡緩沖液II。并用濾紙吸取多余的平衡液（將膠條豎在濾紙上，以免損失蛋白或 損壞凝膠表面）。
13.將IPG膠條從樣品水化盤中移出，用鑷子夾住膠條的一端使膠面完全浸末在1×電泳緩沖液中。然后將膠條膠面朝上放在凝膠的長玻璃板上。 其余膠條同樣操作。
14.將放有膠條的SDS-PAGE凝膠轉移到灌膠架上，短玻璃板一面對著自己。在凝膠的上方加入低熔點瓊脂糖封膠液。
15.用鑷子、壓舌板或是平頭的針頭，輕輕地將膠條向下推，使之與聚丙烯酰胺凝膠膠面完全接觸。注意不要在膠條下方產生任何氣泡。在用鑷 子、壓舌板或平頭針頭推膠條時，要注意是推動凝膠背面的支撐膜，不要碰到膠面。
16.放置5分鐘，使低熔點瓊脂糖封膠液徹底凝固。
17.在低熔點瓊脂糖封膠液完全凝固后。將凝膠轉移至電泳槽中。
18.在電泳槽加入電泳緩沖液后，接通電源，起始時用的低電流（5mA/gel/17cm）或低電壓，待樣品在完全走出IPG膠條，濃縮成一條線后，再 加大電流（或電壓）（20-30mA/gel/17cm），待溴酚藍指示劑達到底部邊緣時即可停止電泳。
19.電泳結束后，輕輕撬開兩層玻璃，取出凝膠，并切角以作記號（戴手套，防止污染膠面）。
20.進行染色。
注：整個雙向電泳實驗中全部使用超純水，盡量減少離子的影響。
五、應用前景
雙向電泳技術是蛋白質組學研究的基礎技術平臺.應用雙向電泳技術分離腫瘤與正常組織細胞之間的差異表達蛋白可為尋找腫瘤的特異標志物、 揭示腫瘤的發病機制以及開發新的腫瘤治療方式及治療藥物等提供新途徑.
電泳技術除了用于小分子物質的分離分析外，主要用于蛋白質、核酸、酶，甚至病毒與細胞的研究。由于某些電泳法設備簡單，操作方便， 具有高分辨率及選擇性特點，已成為醫學檢驗中常用的技術。